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    吖啶酯(NSP-SA-NHS)

    【英文名】:NSP-SA-NHS

    【CAS】: 199293-83-9

    【總貨號】: MB3332

    • 貨號
      規格
    • MB3332-1
      5MG
      MB3332-2
      20MG
    • 產品簡介
    • 產品參數
    • 產品交叉對比表
    • 培養基配方表
    • 質檢證書
    • 說明書

    吖啶酯(NSP-SA-NHS)Cas199293-83-9及其相關化合物已被證明是非常有優勢的化學發光標記物,其穩定性、活性和敏感性超過了某些放射性同位素。吖啶酯能與含有一級氨基的蛋白發生反應。在堿性條件下,NHS 作為離去基團被取代,蛋白質與吖啶酯形成穩定的酰胺鍵。反應完成后,多余的吖啶鹽通過脫鹽柱除去。

    在存在堿性過氧化氫時,吖啶標記的蛋白不需要酶催化可自行發光。具體發光原理是在堿性過氧化氫溶液中,吖啶酯受到過氧化氫離子的進攻,生成一個有張力的不穩定的二氧乙烷,進一步分解成CO2和電子激發態的吖啶酮,當吖啶酮回到基態時發出最大吸收波長430nm的光子。這個發光過程是十分短暫(整個過程的發生小于2秒),觸發方案必須增加內部光度計和光子探測器;另外,本產品也可以使用配備自動進樣器的多功能酶標儀進行發光數據采集。蛋白質,多肽,抗體,核酸都可以用本產品進行標記。吖啶酯在堿性過氧化氫的激發下快速發光,因此通過收集光子可以檢測到標記化合物。

    本產品主要用于:化學發光及免疫分析、受體分析、核酸及多肽檢測等研究。

    儲存條件: ﹣20℃,充氮氣,避光

    運輸條件:  2-8℃,避光

    使用說明(舉例抗體/蛋白質標記):

    1.配制   

    標記緩沖液:0.2M NaHCO3  (pH=9.0);

    標記終止緩沖液: 10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液;

    脫鹽純化緩沖液:0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5);

    吖啶酯發光液:(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

     

    2. 計算標記所用抗體(蛋白質)和吖啶酯的量:

    通常設定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50,具體需根據氨基酸組分進行摸索調整;

    配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液,注意玻璃器皿盛放并避光;

    使用0.2M NaHCO3(pH=9.0) 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應液 。

     

    3. 連接及純化

    本說明書舉例針對標記抗體抗體的分子量為 180kd 對應 15 倍的吖啶酯。如果用戶的待標記樣品是其他的分子量,請參考附表 1 改變試劑的配比。

    1.取 10 µL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml),加入 90 µL 無水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍,配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。

    2.使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀釋 50µg 的抗體至 300 µL,加入 10 µL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)(參考附表 1)。

    3.錫箔紙包好,室溫標記0.5~1h。

    4.淬滅反應,加入 100 µL 標記終止緩沖液,室溫混勻 30 分鐘(注:如果標記較充分,也可以跳過此步驟,直接進行柱純化)。

    5.  脫鹽柱純化,收集吖啶標記蛋白組分并檢測濃度,請參考說明書后文。

    6.  檢測標記的蛋白,取10µL吖啶標記蛋白,放于黑色96孔板中,向每個微孔注入 50 µL~150µL吖啶酯發光液,立即檢測,如果發光過強,可以對標記蛋白再進行若干倍的稀釋,使其在儀器的發光檢測限內。注:吖啶酯發光液最好現用現配,或者將NaOH溶液和過氧化氫溶液分別配成2x母液,使用的時候再1:1進行混合。

    7.  吖啶酯標記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲(注意補加疊氮鈉等防腐劑),如果儲存效果不佳,則請避光保存于-20℃或者-80℃。

     

    注意事項:

    1. 吖啶酯除了DMF,也可以用無水DMSO等非質子性溶劑來溶解。通常吖啶酯用DMF最高溶解的濃度為4mM (約2.7mg/ml),我司生產的吖啶酯中DMSO中溶解度可達10mg/ml。

    2. 標記前,由于吖啶酯末端羧基經NHS活化,較為活潑,請用非質子性的干燥無水溶劑來溶解;標記后,標記后吖啶酯與被標記物之間以酰胺鍵或者酯鍵等形式存在,酸性溶劑基本沒有影響;吖啶酯本身活性位點在堿性和氧化環境下不穩定,因此應根據被標記物的穩定性配制相應的非強堿性非氧化的體系中處理和保存。

    3. 發光標記物在光照條件下有可能部分分解,以致影響發光效果。吖啶酯的實驗操作和儲存建議避光條件下處理,目前暫時沒有具體的研究數據。

    4. 吖啶酯標記蛋白等大分子化合物建議用G25脫鹽柱分離;吖啶酯標記小分子化合物建議用柱層析分離;

    5. 吖啶酯發光過程是十分短暫(整個過程的發生小于2秒),觸發方案必須增加內部光度計和光子探測器;另外,本產品也可以使用配備自動進樣器的多功能酶標儀進行發光數據采集,最大限度降低加樣時間對采集信號的影響。

    6. 吖啶酯標記化學發光檢測儀器推薦:

    美國PE公司的 Wallac 1420 多功能檢測儀,

    德國西門子拜耳化學發光儀ADVIA Centaur

     

    附表 1: 吖啶用量對照表

    蛋白分子量

    吖啶酯工作液

    10kDa-50kDa

    1-3 μL

    50kDa-100kDa

    3-7 μL

    100kDa-150kDa

    7-10 μL

    150kDa-200kDa

    10-13 μL

    200kDa-250kDa

    13-17 μL

    250kDa-300kDa

    17-20 μL

    300kDa-350kDa

    20-23 μL

    350kDa-400kDa

    23-27 μL

     

    吖啶酯標記蛋白效率計算方法

    1. 取100uL 待測樣品,稀釋至Abs280在0.1~1.5之間;

    2. 向1中加入少量鹽酸,調整至pH=1~2,使其形成具有黃色特征的鹽溶液,吸收峰在367nm

    3. 分別測試待測樣品的Abs280nm 和Abs367nm ;

    4. Equation1: 吖啶酯濃度(mol/L)=Abs367/14650 ;

    5. 校正蛋白Abs280數值

    Equation2: Abs280(校正后) = Abs280- (Abs367×0.17);

    6. 準備1mg/ml 未標記的蛋白溶液(e.g. 50ug 蛋白加入50µL 標記緩沖液),取出10µL 并補加490µL ddH2O (稀釋50倍)。讀取Abs280nm ,并乘以稀釋倍數。

    7. 計算蛋白質量濃度(mg/ml)

     Equation3:蛋白摩爾濃度 (mol/L)

    8. 計算F/P摩爾比

     

     

    數據展示

     

     

    圖1.  (A)競品對照的最大溶解度在DMSO為4mM,而美侖吖啶酯實測溶解度可以到15mM (10mg/ml)。圖A中兩管吖啶酯均為4mM DMSO 溶液,美侖與競品對照外觀上沒有明顯差別。(B)多功能酶標儀搭配自動進樣器(BioTek)檢測發光,設定接收信號濾波片460(±40)nm。2.5mg/ml DMSO溶液繼續使用DMSO稀釋500倍后(信號較強,防止燒壞儀器)至終濃度5ug/ml,取20ul 加到黑色96孔板并設置3個復孔,自動進樣器依次進發光液100uL,同時記錄信號值。結果顯示相同濃度的吖啶酯DMSO溶液,美侖組的發光略強于對照公司。(吖啶酯發光液配制:0.01M NaOH+ 0.05% 過氧化氫)

     

     

     

    圖2. 使用較高濃度(10mg/ml)吖啶酯DMSO溶液20uL,直接加入100uL吖啶酯發光液,可以發射出肉眼可見的藍光(430nm)。但是該信號衰減很快,整個發光時間僅有幾秒鐘,因此需要使用具有閃光型化學發光采集功能的儀器進行信號采集。

     

     

    圖3. 蛋白標記效果測試。以吖啶酯標記BSA為例,配制2.5mg/ml 吖啶酯 DMSO母液,溶有15mg/ml BSA 的0.2M碳酸氫鈉溶液(pH9.0)。為了充分標記BSA,避免染料殘留對效果驗證的影響,本次實驗使用的染料摩爾數低于常規用量,按照染料母液:蛋白溶液=1:100 體積比,總體積1ML。室溫標記1h后,過G25脫鹽柱,純化緩沖液為磷酸一氫鈉/磷酸二氫鈉 (1:1) 0.1M 混合體系,PH=6.7(鹽酸微調)。結果顯示,相同的標記濃度體系,同一個G25純化柱純化,吖啶-BSA 發光體系也設定相同,吖啶-BSA流出液的顏色美侖比競品對照更深一些(圖A)。雖然標記前,兩家的吖啶酯光強相似,但是標記后,美侖的光強更有優勢,比對照高一個數量級(圖B),說明蛋白標記對美侖組的吖啶發光基團的影響最小,并且美侖的吖啶酯在堿性標記蛋白質過程中也更加穩定,優于競品對照!

    聲明:本產品供科學研究和生產使用,用于組織和細胞的體外培養。禁止臨床使用

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