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    雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒

    【英文名】:Firefly & Renilla Luciferase Reporter Assay Kit

    【CAS】: V

    【總貨號】: MA0518

    • 貨號
      規格
    • MA0518-1
      100T/盒
      MA0518-2
      1000T/盒
    • 產品簡介
    • 產品參數
    • 產品交叉對比表
    • 培養基配方表
    • 質檢證書
    • 說明書

    產品內容:

    產品組成

    100T

    1000T

    Cell Lysis Buffer (5x)

    10mL

    30mL

    Firefly Luciferase Reaction Buffer

    10mL

    100mL

    Firefly Luciferase Substrate

    1 vial

    1 vial-L

    Stop & Renilla Reaction Buffer

    10mL

    100mL

    Renilla Luciferase Substrate (50x)

    200uL

    1mLx2

    說明書

    1份

    1份

     

    產品簡介:
    報告基因系統廣泛應用于真核生物基因表達和細胞生理學研究,包括受體活性、轉錄因子、細胞信號轉導、mRNA加工和蛋白質折疊等。“雙報告基因”通常被用來提高實驗精確度,即在一個系統中同時表達和測量兩個獨立的報告基因。一般來說,實驗組報告基因與具體實驗條件的影響是相關的,而共同轉染的內對照組報告基因則是用來充當校正參數,作為內參提供反應基線。將實驗組的結果與內對照組的結果進行約化處理,可降低由細胞存活率或轉染效率的差異而導致的結果波動,同時還可消除由取樣體積、細胞裂解效率和儀器測定引起的實驗誤差。因此,雙報告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實驗數據。
    美侖雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Firefly & Renilla Luciferase Reporter Assay Kit)提供了一種有效的雙報告基因檢測方法,在同一個樣品中先以螢光素(Luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase),后以腔腸素(Coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase),同時淬滅Firefly luciferase的螢光信號,實現雙螢光素酶報告基因檢測。該試劑盒可靈敏高效的檢測受基因元件調控的Luciferase表達,通常將轉錄調控元件或5'啟動子區克隆在Firefly luciferase的上游,或把3'-UTR區克隆在Firefly luciferase的下游,構建成報告基因(reporter gene)質粒。將報告基因質粒(Firefly)和內參質粒(Renilla)共轉染細胞,經給藥刺激等操作完畢后,裂解細胞并測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理對目的基因的轉錄調控作用。Renilla luciferase作為校正轉染效率的內參可以消除細胞數量和轉染效率的差異。螢火蟲螢光素酶催化Luciferin發光的最強發光波長為560nm。海腎螢光素酶催化Coelenterazine發光的最強發光波長為465nm,具體波段選用需依據實驗需求和所用儀器進行設定,通常采用全波段接收發射信號即可,不必單獨設置。
    反應原理如下:

     

     

    數據展示

     

     

     

     

    圖1. 螢火蟲螢光素酶發光強度、淬滅效果以及海腎螢光素酶發光強度對比。由圖可知,各組間Firefly luciferase/ Renilla luciferase濃度和比例相同的前提下,美侖組的發光強度高于國產品牌。更為重要的是,美侖組的Firefly luciferase 淬滅效果最佳,遠超國內其他品牌,熒光殘留量僅為0.001%!幾乎完全不影響Renilla再發光,因而具有最高的Renilla 信噪比,使得測試結果更加準確,數據可重復性提高!而其他國產試劑Firefly螢光淬滅很差,背景很高,直接影響Renilla讀值。(儀器:BioTek HTX)

     

     

     

    圖2. 美侖Firefly luciferase螢光信號穩定性(動力學)檢測。從反應初始時刻持續追蹤Firefly luciferase螢光信號30s,可以發現美侖組的螢光信號近乎無衰減,信號穩定性極好,遠遠滿足常規機器操作所需時長?。▋x器參數:VILBER/化學發光/-90制冷CCD)


     

     

    圖3. 美侖組Luminescence-Firefly luciferase濃度梯度標準曲線。在儀器(BioTek HTX)允許的最大測試范圍內,美侖Firefly luciferase 螢光線性檢測范圍可達8個數量級,R2可達0.9996?。▋x器:BioTek HTX)

     

     

     

    TNFa

    20ng/ml

    10ng/ml

    5ng/ml

    2ng/ml

    0ng/ml

    Firefly:Lum

    1835882

    952348

    193674

    44991

    43038

    Renilla:Lum

    21336

    29067

    24360

    25063

    26178

    Firefly/Renilla ratio

    86.046

    32.763

    7.950

    1.795

    1.644

    Firefly/Renilla normalized

    52.336

    19.928

    4.835

    1.091

    1.000

     

    圖4. 美侖雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒實際應用舉例。HEK-293T細胞共轉染了螢火蟲螢光素酶NF-κB response reporter 和海腎螢光素酶內參質粒。轉染后12h,進行TNFα濃度梯度誘導,5h后收集細胞并進行裂解。酶標儀檢測雙酶的信號讀值,對數據進行約化和歸一化處理,詳見表格。上圖為Firefly/Renilla約化數據折線圖,可以明顯看出Firefly/Renilla ratio 與給藥濃度呈正相關,符合預期,并且梯度間變化顯著,提示美侖雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒靈敏度高?。▋x器:BioTek HTX)

     

    使用說明:

    1、自備材料
      PBS溶液;移液器或排槍;黑色酶標板;化學發光儀或酶標儀,可配自動進樣器。

    2、檢測前準備
    (1)首次使用時,將Firefly Luciferase Reaction Buffer 一次性全部倒入Firefly Luciferase Substrate 瓶中,渦旋震蕩,底物充分溶解并混勻后按單次實驗需求量進行適當分裝,避光保存于-70℃,避免反復凍融。
    (2)每次使用前以1:4比例將Cell Lysis Buffer(5x) 與ddH2O充分混合,置于冰上備用。配制體積根據實驗需求,建議現配現用。
    (3)使用時將Renilla Luciferase Substrate(50x) 于冰上避光暫存,計算實際使用量,以50:1的比例將適量的Stop & Renilla Reaction Buffer與Renilla Luciferase Substrate混勻,室溫避光備用。建議現配現用,剩余的反應液當次實驗結束后,直接舍棄,不要留存。

    3、操作方法
    (1)單管檢測方法
    1)裂解細胞
    a.貼壁細胞:吸去細胞培養基,用PBS緩慢輕柔地洗滌一次,洗去殘留的培養基,然后將液體全部吸棄。懸浮細胞:離心去上清后,清洗細胞一次再次離心收集細胞沉淀。
    b.按照下表推薦加入適量的1×Cell Lysis Buffer,室溫下靜置或振動搖晃裂解15min,吹打并吸取全部細胞裂解產物至1.5mL離心管中,16000g離心5min,取上清用于后續檢測。

    Cell Culture Plate

    6-well

    12-well

    24-well

    48-well

    96-well

    1×Cell Lysis Buffer

    500uL

    200uL

    100uL

    50uL

    20uL

    注:若螢光素酶的表達水平過低,可適當減少細胞裂解液用量以提高蛋白濃度,但需保證裂解液體積可以覆蓋細胞孔板底面否則會影響裂解效果。
    2)Firefly Luciferase反應檢測
    小心吸取20uL細胞裂解上清依次加入至檢測管或酶標板中,再加入100uL平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer,迅速混勻后立即于化學發光儀或酶標儀中檢測Firefly Luciferase報告基因活性。(注:務必將反應緩沖液恢復至室溫,使酶促反應在最適溫度25℃進行。加樣后,需要進行混勻,使酶促反應充分穩定進行。本品Firefly 螢光穩定性可達30s以上。)
    3)Renilla Luciferase反應檢測
    在以上反應液中加入100uL現配制的Renilla檢測工作液迅速混勻后立即于化學發光儀或酶標儀中檢測Renilla Luciferase報告基因活性。

     

     

     

    (2)通過自動進樣器進行高通量檢測方法
    1)裂解細胞
    a、貼壁細胞:用排槍吸去細胞培養基,PBS緩慢輕柔地洗滌一次,洗去殘留的培養基,然后將液體全部吸棄。懸浮細胞:參考單管檢測細胞收集方法,不適合原位裂解。
    b、以96孔板為例,用排槍每孔加入20uL 1×Cell Lysis Buffer,室溫下靜置或振動搖晃裂解15min。
    2)雙酶反應檢測
    按照儀器說明書完成自動進樣器的初始化操作,設定自動進樣器1為溶解底物后的Firefly Luciferase Reaction Buffer;自動進樣器2為加入底物的Stop & Renilla Reaction Buffer。設置檢測程序,通過自動進樣器1加入100uL平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer,振板1-2s混勻,檢測Firefly Luciferase報告基因活性。通過自動進樣器2加入100uL的Renilla檢測工作液,振板1-2s混勻,檢測Renilla Luciferase報告基因活性。以此程序完成96孔板的所有樣品檢測。(注:務必將反應緩沖液恢復至室溫,使酶促反應在最適溫度25℃進行。加樣后,需要進行振板混勻,使酶促反應充分穩定進行。本品Firefly 螢光穩定性可達30s以上。)

     

     

     

    注意事項:
    1、檢測儀器選擇:能夠檢測化學發光的儀器都適用本試劑盒的檢測,但是針對相同的樣品,不同檢測器本底信號值和測量值均可能不同,且對于同一樣本檢測,不同儀器的數值不可橫向比較。為防止孔間干擾,推薦使用黑色酶標板。本產品支持配有自動進樣器的酶標儀,可以更好的減小人為操作時間造成的孔間差異,具體操作請參考配套的自動進樣器說明書。
    2、如果體系中螢光素酶表達量較低,可適當減少裂解用量以提高蛋白濃度,同時應增加檢測復孔的數量,以減少低濃度表達造成的孔間差異,確保結果的可靠性。
    3、酶促反應對溫度較為敏感,加樣檢測前務必將細胞裂解產物和檢測底物均平衡至室溫后使用。
    4、為保證螢光素酶檢測試劑穩定性,可采取適當分裝后-70℃冰箱避光保存的方法,以避免反復凍融和長時間暴露于室溫。檢測前根據需要取適量分裝后的反應溶液室溫(25℃)水浴復融,充分渦旋混勻后使用。
    5、裂解產物與Firefly發光反應液接觸后約30s內螢光強度較為穩定,為取得最佳檢測結果,在使用單管的化學發光儀檢測時,不同樣品和底物混合后至上機檢測的時間間隔應盡量一致;使用具有化學發光測定功能的多功能酶標儀時,應先把細胞裂解液在孔內加好,然后采用排槍統一加入檢測底物并盡快上機檢測。
    6、加入Stop &Renilla Reaction Buffer后對于螢火蟲螢光素酶的抑制可以達到99.999%以上,建議通過以下方法提高淬滅效果:使用單管的化學發光檢測儀時,加入抑制緩沖溶液后可緩慢吹打混勻2-3次即可(切勿吹起大量氣泡);使用多功能酶標儀時,可通過增加混勻振幅或延長振動時間(1-2s)。
    7、使用配有自動進樣器的多功能酶標儀進行高通量檢測時,注意選擇合適的進樣速度。加入Firefly Luciferase Reaction Buffer應選擇低速模式,避免形成大量氣泡;加入Stop &Renilla Reaction Buffer可以選擇略高一些的中速模式,有助于液體充分混勻達到更好的淬滅效果。

    保存條件:

    全新試劑盒-20℃保存,一年有效;
    溶解分裝后的Firefly Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年,或-20℃短期保存不超過一個月。

    運輸條件:-10℃干冰運輸。

     

    聲明:本產品供科學研究和生產使用,用于組織和細胞的體外培養。禁止臨床使用

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